麝香酮对大鼠原代脊髓星形胶质细胞损伤及急性脊髓损伤保护的研究

【摘要】第一部分麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤的影响目的建立星形胶质细胞的机械化学损伤模型，评估不同浓度的麝香酮对星形胶质细胞损伤的作用。方法采用差速贴壁法和短期暴露相结合的方法获取脊髓星形胶质细胞。采取2mm间距行―井‖法对培养的星形胶质细胞进行划伤，建立星形胶质细胞的机械模型，在机械模型中加入500mmol/l谷氨酸共培养，建立星形胶质细胞机械-化学损伤模型，在建立模型后24小时用盼蓝染色法测定细胞死亡率、LDH漏出率的检测。对星形胶质细胞进行分组：A组(单纯培养），B组（机械化学损伤后继续培养），C组(机械化学损伤后加入3ug/ml麝香酮），D组(机械化学损伤后加入6ug/ml麝香酮），E组（损伤后加入12ug/ml麝香酮）。分别在6h、12h、24h、48h、72h作MTT检测。在3h、6h、12h时检测SOD、MDA、LDH、TNF-α、细胞内Ca2+。结果获得了95%以上的高纯度的脊髓星形胶质细胞。建立了大鼠原代脊髓星形胶质细胞机械、机械化学损伤模型。24小时A组未见死亡细胞，在机械损伤模型死亡率在23.57%；在机械化学损伤模型死亡率在36.27%。作MTT检测发现C、D、E组细胞损伤程度有所减轻，不同浓度的麝香酮发挥最强功效的时间则不同。在24小时检测LDH的漏出B组比A组明显增加，并随时间的延长而漏出加重，A组无明显的变化，C、D、E组都明显的下降，D组效果最好LDH抑制率(%)达88.27%。SOD检测提示：A组无明显的变化，B组明显的下降，C、D、E组比B组高，以D组在同一时间点最明显。MDA检测提示A组无明显的变化，B组比A组升高，C、D、E组比B组明显低，D组在同一时间点最低。TNF-α检测、细胞内钙检测与MDA有类似的变化。C、D、E组与A组和B组有显著性差异（P＜0.05）。结论成功建立了星形胶质细胞的机械-化学损伤模型；不同浓度的麝香酮对机械-化学损伤的星形胶质细胞都有保护作用，以6ug/ml浓度效果最好。第二部分麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤保护机制的探讨目的探讨麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤的保护机制。方法实验分组：A组（C组加6ug/ml麝香酮）；B组（物理化学损伤模型）；C组（划伤模型）；D组（B组加6ug/ml麝香酮）；E组（B组加50umol/lMK801）；F组（D组加MK801），分别在3h、6h、12h用ELISA法检测上清谷氨酸浓度、流式法检测细胞内钙浓度，在6h时行Q-PCR、westernblot检测EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA、蛋白的表达，并在6h、12h、24h、48h观察各组的形态变化。结果在3个时间点A组谷氨酸浓度比C组低，B组为最高；D组比B组明显低，E组比B组低，但高于D组，F组比B、D、E组低(P＜0.001)。在3h、6h、12h用流式法检测星形胶质细胞内Ca2+浓度，A组比C组降，B组为最高，D组比B组低，E组比B组低，但高于D组，F组都低于B、D、E组；3小时、6小时P＜0.05；12小时，P＜0.0001。选用QRT-PCR检测EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA的表达，在EAAT的mRNA对比值方面，A组比C组低，B组最高，D组比B组明显降低，E组比B组降低，但高于D组，F组比B、D、A组的E组低；在GFAP的mRNA对比值方面，A组比C组低，B组最高，D组比B组明显低；E组比B、D组低，F组最低；在ERK1/2的mRNA对比值方面与GFAP类似，A组最低。westernblot检测EAAT，ERK1/2、GFAP蛋白表达与对应的mRNA的趋势一样。GFAP染色：6小时见明显的划伤带，胶质细胞生长少，A、C组细胞体积增大不明显，未见固缩的细胞；B、D、E、F组见细胞增大、偶见核固缩；以B、E组明显，偶见坏死。12小时划伤带仍明显，胶质细胞生长较多，核固缩，在B、D、E、F组出现了坏死，以B组明显。24小时划伤带隐约可见，细胞增生、肥大明显；B组见大量核固缩、坏死；C组偶见核固缩；D组可见划伤致坏死，增生肥大细胞少；E组细胞肥大，核固缩、坏死并存；F组细胞肥大，可见核固缩。48小时各组见划伤区细胞肥大明显，核固缩，A组最轻，C组次之；B组最明显，核固缩、坏死并存较多，其余组比B组轻。结论麝香酮降低了星形胶质细胞膜上EAAT的mRNA和蛋白的表达、降低了谷氨酸的浓度，抑制了钙内流，抑制了ERK1/2、GFAP的mRNA和蛋白的表达，抑制了星形胶质细胞的肥大、增生。第三部分麝香酮对大鼠急性脊髓损伤保护的研究目的评估麝香酮对大鼠急性脊髓损伤的作用效果。方法用Allen’s法建立急性脊髓损伤模型，将120只大鼠随机分成五组，NS组（生理盐水组）、MP组（甲基强的松龙组）、MO1组(麝香酮2.5mg/kg)、MO2组(麝香酮5mg/kg)、MO3组(麝香酮10mg/kg)。MO1组、MO2组、MO3组为脊髓损伤后立即分别从尾根静脉注入2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的麝香酮，连续7天；MP组为术后立即注入30mg/kg的甲基强的松龙；NS组则注入等量生理盐水。术后在3h、8h、1d、3d、1w、2w每组随机取4只动物，提取血清，ELISA法检测SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-ａ；术后8h、1d、3d、1w、2w、4w每组随机取3只动物，切取脊髓组织，行H-E染色、尼氏染色、免疫细胞化学染色：GFAP，并计算每视野观察到的胶质细胞个数。术后1d、3d、1w、2w、4w各取1只动物Western-Blot法检测bcl-2、caspase-3、GFAP的蛋白表达。所在数据并行统计分析。结果1、成功建立了急性脊髓损伤模型。2、ELISA法检测(1)SOD:NS组从术3小时至1周呈下降趋势，在2周时上升。MP组与麝香酮处理的3个组，从3小时逐渐上升在3天达峰值，后出现下降，在同一时间点，明显高于NS组，以MO3组最为明显，2周时最明下降，以MO1组最明显，MP组次之，MO2组仍最高。6个时间点，P＜0.001，所两两比较都有显著性差异。(2)MDA:NS组从3小时上升至1周，在2周时下降。MO3组值8小时达峰值，1天后出现了下降，MP组3天达峰值，后出现下降。MO1和MO2有MP组的趋势，MO2下降最低，各时间点，P＜0.001。(3)TNF-α:NS组从3小时缓慢上升趋势，2周时出现下降，其余四组在相同时间点较NS组低，以MO2组最低；MP组在1天时达峰值，后缓慢下降。MO3在8小时达峰值，后下降。(4)IL-β和IL-6与TNF-α有类似的趋势，各时间点，都低于NS、MP组，P＜0.001。3、病理学观察：HE染色：在建模后8小时打击区下方广泛的出血、细胞水肿、固缩，以NS组最明显，MP组次之，在麝香酮所处理的3个组中，MO2出血较少，其余两个组仍较多。打击区下方与中央管间出现了空洞，随着时间的推移，出血减少，脊髓组织出现了坏死、溶解，星形胶质细胞增生，1周时显著增加，2周时达顶峰，后缓慢下降持续，在4周时NS组空洞扩大，中央管消失，MP组仍见散在的小空洞，部分为胶质细胞增生充填，3个剂量麝香酮所处理的脊髓空洞基本消失，MO2炎症反应最轻。尼氏染色：8小时NS组出现较多的胶质细胞，尼氏小体肿大明显、碎裂、分布不均，神经元缩小；MP组尼氏小体肿、聚积，神经元缩小，仍较完整；在麝香酮所处理的3个组中，MO2组神经元较多，形态较正常，尼氏小体分布正常，胶质细胞增生少。随着时间的推移，NS组胶质细胞增生，神经元固缩，核碎裂，结构消失，取而代之的是增生的胶质细胞，4周时见少量残存神经元，固缩明显。在同一时间点麝香酮所处理的3个组中，MO2组神经元数量较多，结核较完整，仍减少，卫星现象不明显，MO1、MO3组及MP组的神经元损伤介于生理盐水组与MO2组间，卫星现象明显。脊髓后侧角、损伤区出现类似的变化。GFAP染色：NS组1周时胶质细胞增生明显，2周时达顶峰，为155.8/视野，后缓慢下降，4周时102.2/视野，MP组明显低于NS组，在1周时达峰值125.8个/视野，后缓慢下降，4周91.8/视野，麝香酮处理的3组胶质细胞增呈下降趋势，在2周出现轻度上升，同一时间点低于NS组和MP组，以MO2最低，4周时47.4/视野。Western-Blot检测提示NS组caspase3、GFAP最高，Bcl-2最低，MO3组caspase3、GFAP最低，Bcl-2最高、其余各组在这两者之间。NS、MP组与MO组各时间点比较有显著性差异（P＜0.05）。采用BBB评分：5个实验组术后第1、3天，双下肢功能无明显变化，多处0-1级，双下肢功能逐渐改善，NS组在4周时达8.2，MP组达13.6，麝香酮处理后三组改善明显优于MP组和NS组，MO2组恢复最明显，在2周时达10.0，4周时达18.6。1d、3d时，P＞0.05,无统计学意义；1w时，P＜0.05,NS组与MO1组、MO2组、MO3组有显著性差异；2w时P＜0.05,MP组与MO1组比较无统计学意义，其余各组间两两比较有显著性差异；3w时P＜0.05，NS组、MP组与其余3组间比较有显著性差异；4w时P＜0.05，NS组、MP组与其余3组间比较有显著性差异。结论不同浓度的麝香酮对大鼠急性脊髓损伤通过抑制免疫炎症反应，下调了caspase3的表达，上调了bcl-2的表达，减轻了神经细胞的坏死和凋亡，降低GFAP的表达，抑制了星形胶质细胞的过度增生，改善了急性脊髓损伤后双下的功能，以5mg/kg剂量效果显著，并优于甲强龙。
【作者】郭亮；
【导师】蒋电明；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】急性脊髓损伤；星形胶质细胞；谷氨酸；麝香酮；炎症；

【参考文献】
[1]张秦怡.CNTs增强的Ni(OH)_2/石墨烯复合材料的制备及性能研究[D].西南石油大学,2014.
[2]吕玉兰.制造业企业物流模式及其选择研究[D].东南大学,2005.
[3]王超.杨凌示范区五泉镇建设研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[4]欧宇.企业并购整合之路[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[5]张坤霞.我国石磺科形态结构再描述及同工酶分析[D].上海海洋大学,海洋生物学,2013,硕士.
[6]屈秋瑶.共掺杂纳米TiO_2的制备及光催化降解NO_2~-的效能[D].黑龙江大学,分析化学,2013,硕士.
[7]郭太品.基于fMRI技术针刺太冲穴对不同状态受试者脑功能的影响研究[D].成都中医药大学,针灸推拿,2012,硕士.
[8]折瑞.“导学案”在高中英语阅读教学中的应用[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[9]李洋.SBA-15固定化脂肪酶催化合成棕榈酸乙酯的研究[D].吉林大学,微生物与生化药学,2014,硕士.
[10]戴仁彪.国际恐怖主义犯罪基本问题探析[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[11]薛裕钧.吴江市全球基金流动人口项目结核病人系统管理状况及其效果评价[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[12]敖堂波,催兆俊.RH炉EIC三电系统调试问题的解决方案[J].冶金自动化,2012,05:72-75.
[13]陈宝月.基于步距规的数控机床单轴受力误差测量和补偿方法研究[D].广东海洋大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[14]王钊.基于模糊控制算法的重介选煤课题研究[D].曲阜师范大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[15]张汉波.技术创新投资决策的期权博弈研究[D].中北大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[16]宋森,谷加存,全先奎,郭大立,王政权.水曲柳和兴安落叶松人工林细根分解研究[J].植物生态学报,2008,06:1227-1237.
[17]魏志锋.李宁、王昌兵过失致人死亡案的法律分析[D].兰州大学,刑法学（专业学位）,2013,硕士.
[18]乌云娜.复杂网络中基于非理性博弈的舆情传播模型的研究[D].吉林大学,计算机技术,2014,硕士.
[19]李灿飞.基于偏微分方程的医学图像增强与分割方法研究[D].湖南大学,2012.
[20]闫培玻.人民币升值下外向型中小企业政策支持体系研究[D].广东海洋大学,行政管理,2013,硕士.
[21]辛航.西部森林生态旅游效益评价及发展对策研究[D].北京林业大学,统计学,2013,硕士.
[22]孟娜.超高层框架—核心筒结构静动力弹塑性分析与研究[D].河北工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[23]尹莹.基于GIS的浪溪河地表水—地下水相互作用研究[D].中国矿业大学,地图学与地理信息系统,2014,硕士.
[24]郑新军,李嵩,李彦.准噶尔盆地荒漠植物的叶片水分吸收策略[J].植物生态学报,2011,09:893-905.
[25]张学广,刘义成,海樱,徐殿国.改进的配电网双馈风电场电压控制策略[J].中国电机工程学报,2010,07:29-35.
[26]金岩.城市小学生课外补民商法学现状的调查与分析[D].曲阜师范大学,小学教育（专业学位）,2013,硕士.
[27]宇文晶.保险电子营销发展研究[D].东北财经大学,2005.
[28]王林元.信号微机监测系统和基层综合信息网[J].中国铁路.1999(11)
[29]盛智梅.面向水下传感器网络压缩感知多用户检测技术[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[30]周莹莹.求解非线性微分差分方程的两个改进方法[D].渤海大学,基础数学,2014,硕士.
[31]王威,方滨兴,崔翔.基于终端行为特征的IRC僵尸网络检测[J].计算机学报,2009,10:1980-1988.
[32]曾祥明.重庆市万盛区机关人事工资管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[33]张阿樱1,2,吕海宝2.MWCNT纳米纸/形状记忆聚合物复合材料导电性能研究[J].哈尔滨工程大学学报,2014,04:.
[34]肖遥,张小武,邬雄,林志波,李澍森,张广州,万保权.HVDC换流站取消载波通信噪声滤波器的可行性[J].电力系统自动化,2007,10:102-107.
[35]庄代波.一种Apriori的改进算法[J].绍兴文理学院学报(自然科学),2003,09:36-40.
[36]王天骄.厚板窄间隙非自熔性激光多层焊接研究[D].华中科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[37]徐翔.电弧的温度场、速度场及辐射对螺旋不稳定性影响的数值模拟[D].大连理工大学,等离子体物理,2004,硕士.
[38]李慧.山地丘陵区LUCC的生态效应研究[D].华中师范大学,区域规划与发展,2012,硕士.
[39]李虹,李卫国,毕天姝,熊浩清.基于WAMS的电力系统实时状态估计和预报[J].电力系统自动化,2009,16:35-39+49.
[40]刘晓丽.跳—扩散模型一种新的参数估计方法及应用[D].北方工业大学,应用数学,2013,硕士.
[41]梁斌梅.基于J2EE和RUP的ERP研究与开发[D].西南交通大学,2004.
[42]张晓文.杂多酸复合物修饰电极的制备及其电催化性能研究[D].湖北师范学院,2012.
[43]仲莉芬.大型装船机主机结构运动学及动力学仿真分析[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[44]刘强.姜黄素经胰岛素样生长因子-1通路抑制缺氧肝癌HepG2细胞VEGF表达的机制研究[D].厦门大学,外科学,2014,硕士.
[45]严俊.叶腊石矿物学特征及其应用研究[D].浙江工业大学,应用化学,2012,博士.
[46]孙胜男.会议信息[J].中国会展,2004,01:76.
[47]孙亮,杨春晖,马天慧,朱崇强.非线性光学晶体LiBX2(B=Ga,In;X=S,Se,Te)的研究[J].化学进展,2014,03:.
[48]黄文.东亚货币合作可行性与中国的战略选择[D].云南财经大学,国际贸易学,2013,硕士.
[49]冷强奎,李玉鑑.组合凸线性感知器的极大切割构造方法[J].自动化学报,2014,04:721-730.
[50]闫莎莎.铁路强电磁干扰对信号系统的影响[D].北京交通大学,2014.